要求主要包括以下几点：
划线的起始部分应该使用火焰灼烧过的接种环，确保接种环上的菌种来自单一来源，避免交叉污染。
划线时应该保持力度均匀，线条清晰，避免线条交叉或重叠，以便于观察和分离单个菌落。
划线应该从平板的一边开始，逐渐向另一边移动，同时逐渐改变方向，以确保菌种在平板上均匀分布。
划线结束后，应该使用火焰灼烧接种环，以杀死接种环上的菌种，避免对后续操作造成污染。
此外，在划线过程中，还需要注意以下几点：
保持无菌操作，避免杂菌的污染。
划线前应该确保平板表面干燥，避免菌种在湿润的表面上扩散。
划线时应该避免过度用力，以免刮破平板表面，影响菌落的生长。
总的来说，用平板划线法进行分离纯化对划线的要求包括保持无菌操作、均匀分布菌种、避免交叉污染等，以确保能够成功分离出单一的菌落。
第二次划线从第一次划线的尾部开始，并且最后一次划线不能和第一次划线相连。
