1. 试剂准备阶段
试剂准备是 PCR 操作的第一个流程，需要在试剂贮存和准备区的超净工作台或生物安全柜进行，用确保无污染的移液器、枪头及容器等进行分装。所有的 PCR 体系都应该在 - 20℃ 保存，除了 ddH 2 O 之外，其余的试剂组份需完全融化之后再加入，以免影响浓度。配制反应体系应在快速进行，以减少非特异性扩增。体系配制完成之后应马上进行 PCR 反应。
2. 样本制备阶段
样本制备是整个 PCR 反应中最为关键的环节，在接收样本时一定要确保样本的密封性以及样本编号的唯一性。严格遵守操作规程进行加样操作，操作时候尽量少说话或者不说话。
所有操作需要在生物安全柜内进行，操作前后生物安全柜需要进行紫外灯消毒，注意生物安全柜中物品的排放。戴手套并勤于更换，要有「无核酸观念」 。
3. 核酸扩增
在核酸扩增环节需要选择质量好的 Ep 管，装入反应体系的 EP 管上机前混匀、离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。在样本检测的同时设立对照（阳性对照、阴性对照、阴性模板、试剂对照）。同时严密检测 PCR 扩增仪的各项性能指标，其中对 PCR 扩增仪而言温度控制就意味着质量。
4. 产物分析
常见问题：
1）无 CT 值出现：模板量不足（杂质的引入及反复冻融的情况等）
2）CT 值出现过晚（大于 38）：各种反应成分的降解或加样量的不足
3）标准曲线线性相关性不佳：加样误差、标准品出现降解等
4）阴性对照有信号：模板有基因组的污染
5）扩增效率低：反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解、反应抑制
6）扩增曲线的异常：模板的浓度太高或荧光染料的降解
四、实验室操作环境的维护
1） 各工作区要有一定的隔离，进入工作区域应按照单一的方向进行。试剂贮存和准备区 → 标本制备区 → PCR 扩增区 → 产物分析区单一方向进行。
2） 各个区域实验用品专用：各个区域实验设备和物品应有明确的标记，不能混用。
3） 实验场所要保持通风良好，严格监测各个工作区的温湿度。
4）注意实验室污染的预防。
整个 PCR 实验的操作都需要特别注意避免污染，来自样本的、试剂的以及实验室各种气溶胶，要始终保持「无核酸观念」。
一．试剂准备
1.DNA 模板
2.特异性引物
3.dNTP Mix
4.PCR buffer
5.热启动酶
二．操作步骤
1.配置反应体系
将各成分依次加入到 0.5ml 的离心管中
扩增使用热启动酶，可在常温下操作，非热启动型的酶要在低温配置反应体系。
2.按照试剂盒说明书设置反应时间和温度，扩增结束后电泳鉴定
3.琼脂糖核酸电泳
· 将电泳所用器具蒸馏水洗净，架好梳子
· 根据要分离的 DNA 片段大小制备合适浓度的琼脂糖凝胶，准确称取一定的琼脂糖加入到锥形瓶中，加入 30ml 左右的电泳缓冲液（TAE 或 TBE）
· 在微波炉中加热融化后冷却至 40℃左右，充分混匀后倒入电泳槽中
· 室温下凝固 40 分钟左右，小心拔出梳子，将凝胶放置电泳槽中准备点样
· 在电泳槽中加入电泳缓冲液，漫过凝胶表面即可，点样孔内不要有气泡
· 样品点样前准备好，（在八连管中）加入 5ul 样品，1ul 的 6xLoding buffer 和 1ul 的染料混合，用抢将混合后的样品缓缓注入到点样孔中，注意不要串孔
· 按照正负极（红正黑负），接通电源，电压 40-60V，时间 30-40min，可根据溴酚蓝的位置判断是否终止电泳
· 电泳结束，关闭电源，凝胶成像观察，并对比 marker 确定片段大小
不同的琼脂糖浓度分离不同大小的 DNA 片段：
三．注意事项
引物
引物是决定 PCR 反应成败的关键，要保证扩增的准确、高效，引物的设计要遵循如下原则：
1. 引物的设计在 cDNA 的保守区域，在 NCBI 上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析的软件，得到不同基因相同的序列就是该基因的保守区
2. 引物的长度：15-28bp，长度大于 38bp，会使退火温度升高，不利于普通 Taq 酶的扩增
3. 引物 GC 含量在 40%-60%，Tm 值最好接近 72℃
4. 因密码子的简并性，引物的 3’端最好避开密码子的第三位（最好为 T）
5. 碱基分布错落有致，3’端不超过 3 个连续 G 或 C
6. 引物自身不要形成发夹结构，引物设计完成，要 BLAST 验证
